鉴于生命系统的动态和复杂特性，几乎不可能凭借极小的局部区域的特征来预测系统性行为。要研究系统的生物学特性，例如跨皮质区域的神经网络活动、白细胞运输动态或肿瘤转移，需要一台至少具有毫米级视场和亚细胞分辨率的显微镜以视频帧率来记录动态的生物活动。这需要具有高空间带宽积(分辨率X视场）的光学系统和具有高数据吞吐量(像素数X帧率)的采集系统。最近发明的Mesolens显微镜，已经展示出大视场下高分辨率成像能力。在共聚焦扫描模式下，Mesolens 可以从毫米级样本中收集大量信息，并已用于对整个固定的 12.5 天大的完整小鼠胚胎进行成像。
厘米尺度和微米分辨率的生物动力学视频帧率成像
技术背景：
鉴于生命系统的动态和复杂特性，几乎不可能凭借极小的局部区域的特征来预测系统性行为。要研究系统的生物学特性，例如跨皮质区域的神经网络活动、白细胞运输动态或肿瘤转移，需要一台至少具有毫米级视场和亚细胞分辨率的显微镜以视频帧率来记录动态的生物活动。这需要具有高空间带宽积(分辨率X视场）的光学系统和具有高数据吞吐量(像素数X帧率)的采集系统。最近发明的Mesolens显微镜，已经展示出大视场下高分辨率成像能力。在共聚焦扫描模式下，Mesolens 可以从毫米级样本中收集大量信息，并已用于对整个固定的 12.5 天大的完整小鼠胚胎进行成像。
光学系统与尺度相关(scale-dependent)的几何像差从根本上限制了显微镜的 空间带宽积，使得可实现的分辨率和视场是一对矛盾量。当前有两种方法可以绕过这个难题：（1）图像拼接，大尺度的样本通过逐个小区域扫描完成整体采集；(2) 傅里叶叠层成像，使用大视场、低分辨率成像系统，通过采集大量不同照明条件下的大视场低分辨率图像，在傅里叶域进行后处理获得最终图像。不幸的是，它们在高分辨率下的性能代价是牺牲了时间分辨率。例如，在傅立叶叠层显微镜中获得十亿像素图像需要大约 3 分钟。这些技术的数据吞吐量远不足以支持单次、全视场信息采集。此外，在这两种情况下，整个视场成像的全过程中样本都需要保持静止，这在活体成像中是很难实现的，对清醒、活动的动物成像时更甚。当需要高速成像时，必须选择感兴趣的小区域。因此，它们不可能用于生物动力学的大尺度成像。对于高空间带宽积天文学，已经提出了非平面成像表面的望远镜，成功地减轻了设计和制造方面的挑战。
当前不足：
对于系统生物学中非常需要的动态成像，Mesolens显微镜数据吞吐量有限。例如，在具有亚细胞分辨率的哺乳动物皮层全脑功能成像中，以视频速率(>10 fps用于钙成像)采集，成像系统应具有 ~10 mm × 10 mm 视场，~1 μm 分辨率，相应的数据吞吐量应大于每秒 4 gigapixels。在19年本文发表前，这样的系统还未出现。
非平面成像表面的望远镜设计是鼓舞人心的，但将这样的策略从望远镜转向显微镜并非易事。
文章创新点：
基于此，清华大学的Jingtao Fan(第一作者)和Qionghai Dai(通讯作者)提出了一种实时、超大尺度、高分辨率成像的宏观显微镜(macroscope)，它实现了厘米级尺度(10mmX12mm)和微米级分辨率(525nm时横向分辨率0.92um)的生物动力学视频速率(30fps)、十亿像素(gigapixel)成像，数据吞吐量高达 5.1 gigapixels/秒。
（1）物镜采取平面-曲面的成像策略，设计全新的显微物镜成像光路，实现物镜将物方大视场的平面与像方的凹形中间像面对应，从而极大的减小几何像差(特别是场曲)。
（2）采集单元镜头采取曲面-平面的成像策略，受昆虫复眼的启发，凹形中间像面被分成35个小视场，并被35个中继镜头组(采集单元)重新成像到平面scmos上，scmos水冷处理至10℃，保持低噪声水平。
原理解析：
（1）降低几何像差，放大中间像面。当视场和数值孔径变大时，场曲和其它几何像差会迅速增加。获得均匀分辨率的大的平面像需要极度复杂的光学设计，实现起来很困难。采用曲面像面设计策略，可以极大的减小如场曲这样的几何像差。如图1a，设计一个14片的物镜(直径161mm，长280mm，0.35NA ，使用Zemax设计)，成半径为1.9m的凹面中间像面以与场曲适配。如此大的半径的曲面，便于下一步的子视场分割及并行采集。
（2）子视场分割，并行采集。将凹面视场分成35个子视场，用35个中继镜头组并行采集，每个子视场的主光线垂直于中间像面，相邻子视场重叠率为3.6%，如图1a。
（3）校准和装配。采取快速计算在环(computation-in-loop)的校准策略，获得亚像素的校准精度，并提供用于组装相机阵列所需要的反馈。如图2，第一步：使用高密度的LCD模组(500PPI)上不同单元的时分编码来设置全局物理坐标，具体来说，12-bit时间编码分别用于x和y坐标；第二步：每一个子视场相机采集LCD上一个特定小区域的图像序列，因此每个LCD单元上相应的全局位置可以通过时间模式编码；第三步：对每个子视场图像里的LCD单元，使用面积中心(centre-of-area)方法(包含二值化和权重平均)进一步提取精确的局部图像坐标；第四步：获得所有子视场的局部和全局坐标后，建立一组单应矩阵(homographic matrices){Hi}用于无缝连续拼接。
（4）采集，存储和无缝拼接。设计一个九节点的计算机集群来适应传输、存储和处理所需的巨大带宽(见图3)。通过这种设置，35 张图像（每张 5.5 百万像素）被同步连续捕获，最大帧率高达 30fps。捕获的数据通过双摄像头链接传输到光缆。在35线双工光网络(35-cable duplexing optical networks)中，图像传输带宽达到每秒5.1 千兆像素，实现了一个带有 324 个硬盘（每个 4TB）的分布式文件系统。该分布式文件系统用于调度本地数据写入请求到每个节点，并使用元数据集群机制提供跨节点数据交换能力，促进了高度并行且粒度(granularity)可调的分布式拼接算法。因此，可以根据感兴趣的区域实现自适应分辨率调整的实时在线拼接，并且可以以高达 1.1 fps 的速度对整个十亿像素视频进行拼接和离线存储。
视频1：清醒小鼠血管和钙信号的成像
视频2：小鼠神经活动的钙成像
附录：
参考文献：Fan, J., Suo, J., Wu, J. et al. Video-rate imaging of biological dynamics at centimetre scale and micrometre resolution. Nat. Photonics 13, 809–816 (2019).
DOI：https://doi.org/10.1038/s41566-019-0474-7
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