飞秒激光由于其超快时间特性和超高值功率特性在生物学应用领域取得了重大的成功,飞秒激光与生物材料作用的机理研究引起了众多学者的浓厚兴趣,通过近数十年的研究已经得到了突破性的进展,本文综述了飞秒在现代生物学领域中的一些应用,包括激光生物效应,活细胞微手术,直写微纳加工应用,细胞成像等.
飞秒激光在生物学方面的应用
1.飞秒激光特点
1960 年 7 月，美国人 Mahaan 博士研究出世界上第一台激光器(红宝石激光器)。激光作为一种新型的光源具有以往光源所不具有的一系列优点，如高强度、高方向性、高单色性、高相干性。此后，激光技 术得到了飞速发展，其中一个重要方向就是向输出脉宽越来越窄的脉冲方向发展。到目前为止，脉冲持续时间已由纳秒(ns)、皮秒(ps)压缩至飞秒(fs)，甚至至阿秒(as)级。故飞秒激光的脉冲持续时间远短于热平衡时间(10−12 s 数量级)，所以在与物质作用时，飞秒激光注入的能量被集中在一个空间极小的范围内， 其能量几乎不会被传递到直接作用区以外，对作用区周围的热影响极小。由于聚焦激光的焦斑尺寸极小， 能量密度极高，能量的利用率亦大大提高。这使得被作用区域的温度在极短时间内升到极高，远超过材 料的液化和气化温度，促使物质发生高度电离，达到等离子态。同时，由于飞秒激光的强度在空间上一 般呈高斯分布，即激光焦斑中心强度最大，而随着向边缘的过渡其强度逐渐减弱，因此，飞秒激光能在 极短的时间、极小的空间和极端的物理条件下对生物细胞进行作用。
飞秒激光在生物方面的应用，飞秒激光在材料科学领域所表现出来的微纳加工和处理优势在生命科学方面同样适用，其在生物体 内所能实现的三维精确微创手术为医学领域的发展提供了新的机会。在对细胞和组织的处理和切除方面，飞秒激光已逐渐成为一个重要的工具，并取得了很多令人振奋的实验结果。
飞秒激光亚细胞器手术。为了研究细胞的生长、运动、新陈代谢、有丝分裂、分化和凋亡等行为，需要对细胞内的细胞骨架 或细胞器进行处理，传统的工具由于空间分辨率不高且对细胞损伤较大制约着该领域的发展，飞秒激光 的出现无疑为该领域注入了新的活力。 2006 年哈佛大学 hmar 等人采用飞秒激光手术在活细胞内切割了单根肌动蛋白丝，研究其收缩动力 学及细胞形状的变化，如图 1 所示。
日本大阪大学采用飞秒激光在活的 NIH3T3 细胞内切割了单根肌动蛋 白丝，发现切割后十分钟后，断裂的肌动蛋白丝重新愈合，从而实现了对细胞内纤维解聚和组装的人 为调控，为各种细胞内动力学过程的研究奠定了基础。 大阪大学用飞秒激光手术在海拉细胞中实现了单个线粒体的蚀除，而没有破坏细胞周围其它结构， 实验后 12 小时，被手术的细胞进行了正常的有丝分裂。德国耶拿大学的 TirlaPur 等人用飞秒激光在植 物细胞里实现了半个叶绿体的蚀除，应用 80 MHz 钦篮宝石激光对人类的染色体进行点蚀除和线切割,同 时应用原子力显微镜对细胞进行观察。
2.飞秒激光细胞膜手术。 由脂和蛋白质分子构成的细胞膜是防止细胞外物质进入细胞的屏障，它保证了细胞细胞内环境的相 对稳定，使各种生化反应能够有序进行。细胞膜的流动性不仅是膜的基本特性之一，也是细胞进行生命 活动的必要条件。通过膜脂质流动性的改变可反应出细胞膜的功能状态及膜受损伤的程度，同时，膜的 流动性也决定了其具有自动愈合的能力。细胞膜与飞秒激光结合具有广泛的应用前景，如细胞融合、细胞分离、转基因、辅助受精等。 2002 年，Tirlapur 等人用钦蓝宝石飞秒激光器产生的飞秒激光在细胞膜上产生单个的!特定位置的瞬 时穿孔，允许 DNA 通过并保存了细胞的完整性。 2005 年，Kohil 等人用飞秒激光对哺乳动物细胞进行亚微米细胞膜切割和细胞分离，并保持了细胞 的活性。2008 年，天津大学的王清月等人用波长 800 nm，脉宽 40 fs 的飞秒激光对酵母细胞进行融合， 同时用 ccd 检测细胞的融合过程，靶细胞在手术 160 分钟后成功实现了细胞融合，如图 2 所示。
3.飞秒激光生物活体手术。展研究无疑是对医学技术水平的一大挑战。飞秒激光作为一项新兴技术，自产生以来对生物活体的研 究就非常受人们的重视。 国内外学者利用飞秒激光在生物活体上开展了大量的研究工作，其中最为成熟并在临床上有应用的 是飞秒激光角膜屈光手术和角膜移植手术，该技术的应用使手术本身更安全并且术后视觉质量恢复的更 好，此外还有不少的研究停留在实验阶段，如斯坦福大学 Ginzton 实验室使用飞秒激光对线虫的轴突 进行外科手术，手术后这些轴突实现了功能性再生，采用飞秒激光手术对细胞和组织的修正和切除在生 物和医学领域逐渐成为一个重要的工具，在神经损伤再生、组织病变的诊断和治疗、皮肤美容等方面无 疑都具有一定的应用前景。
通过介绍飞秒激光在在细胞微手术、微纳加工和细胞成像等领域中的应用实例，证明飞秒激光在生物学中的应用前景将更为广阔。尽管飞秒激光手术具有如此大的优越性，但在实际的临床中应用还 比较少，主要由于飞秒激光器还存在稳定性、价格昂贵、结构庞大、可操作性差和对特殊生物组织的可 复性损伤阈值问题等，需要进一步改进和完善。
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